آزمایش میکروبی آب به روش MPN (Most Probable Number یا بیشترین تعداد احتمالی) یکی از معتبرترین و قدیمیترین روشهای آماری-آزمایشگاهی برای شناسایی و شمارش باکتریهای شاخص آلودگی (بهویژه کلیفورمها) است.در این مقاله جامع، ابتدا نگاهی سریع به این روش خواهیم داشت و سپس به صورت گامبهگام، اصول، مراحل عملی، مزایا و نحوه تفسیر جدول MPN را بررسی میکنیم.
آزمایش میکروبی آب به روش MPN چیست؟ (خلاصه و مقدمه)
اگر بخواهیم خیلی ساده بگوییم، آزمایش میکروبی آب به روش MPN یک روش کشت لولهای چندگانه است که بر پایه علم آمار و احتمالات بنا شده است. در این روش، حجمهای مشخصی از نمونه آب به لولههای حاوی محیط کشت مایع اختصاصی اضافه میشود. پس از طی زمان انکوباسیون، بر اساس مثبت یا منفی شدن لولهها (تغییر رنگ یا تولید گاز)، یک کد سه رقمی به دست میآید. تکنسین آزمایشگاه با ارجاع این کد به «جدول استاندارد MPN»، میزان تراکم باکتریها را در ۱۰۰ میلیلیتر از نمونه آب تخمین میزند.
هدف اصلی این آزمایش، شمارش شاخصهایی مانند کلیفورمهای تام (Total Coliforms) و کلیفورمهای گوارشی (Fecal Coliforms) است که حضور آنها نشاندهنده آلودگی احتمالی آب با مدفوع انسان یا حیوان و خطر وجود پاتوژنهای خطرناک است.
چرا از باکتریهای کلیفورم به عنوان شاخص استفاده میشود؟
شناسایی تکتک ویروسها، باکتریها و انگلهای بیماریزا در آب کاری زمانبر، هزینهبر و گاهی غیرممکن است. بنابراین، متخصصان از باکتریهای خانواده کلیفورم (بهویژه ایکولای یا E. coli) به عنوان شاخص آلودگی استفاده میکنند.
-
فراوانی: این باکتریها به تعداد دفعات بسیار زیاد در روده انسان و موجودات خونگرم وجود دارند.
-
مقاومت: پایداری آنها در آب تا حدی شبیه یا بیشتر از پاتوژنهای رودهای است.
-
سهولت تشخیص: کشت و شناسایی آنها در آزمایشگاه بسیار آسانتر و ارزانتر از ویروسها یا باکتریهایی مانند سالمونلا است.
اصول و تئوری آماری روش MPN
آزمایش میکروبی آب به روش MPN برخلاف روش فیلتراسیون غشایی (Membrane Filtration) که کلونیها را مستقیماً میشمارد، بر اساس تئوری توزیع پواسون در آمار کار میکند. فرض بر این است که باکتریها به صورت یکنواخت در نمونه آب پخش شدهاند. وقتی نمونه را رقیق کرده و در لولههای متعدد تقسیم میکنیم، احتمال اینکه در برخی لولهها هیچ باکتری زنده ای وارد نشود و در برخی دیگر یک یا چند باکتری وارد شود، قابل محاسبه است.
به طور استاندارد از سیستمهای چند لولهای استفاده میشود:
-
سیستم ۵ لولهای: دقت بالاتری دارد و معمولاً برای آب آشامیدنی با آلودگی کم استفاده میشود.
-
سیستم ۳ لولهای: رایجتر است و برای نمونههایی با آلودگی متوسط تا شدید (مثل آبهای سطحی و فاضلاب) کاربرد دارد.
مراحل گامبهگام آزمایش میکروبی آب به روش MPN
این آزمایش معمولاً در سه مرحله مجزا انجام میشود تا از صحت نتایج اطمینان حاصل شود: مرحله احتمالی (Presumptive Test)، مرحله تائیدی (Confirmed Test) و مرحله تکمیلی (Completed Test).
۱. مرحله احتمالی (Presumptive Test)
در این مرحله، هدف ما فراهم کردن شرایط برای رشد هرگونه باکتری کلیفورم موجود در آب است.
-
محیط کشت: معمولاً از محیط کشت لوریل تریپتوز برات (Lauryl Tryptose Broth) یا لاکتوز برات (Lactose Broth) استفاده میشود. درون هر لوله آزمایش یک لوله کوچک وارونه به نام لوله دورهام (Durham tube) برای جمعآوری گاز ایجاد شده قرار میگیرد.
-
نحوه تلقیح (سیستم ۳ لولهای استاندارد):
-
۳ لوله حاوی محیط کشت با غلظت مضاعف (Double Strength): هر کدام با ۱۰ میلیلیتر نمونه آب تلقیح میشوند.
-
۳ لوله حاوی محیط کشت با غلظت معمولی (Single Strength): هر کدام با ۱ میلیلیتر نمونه آب تلقیح میشوند.
-
۳ لوله حاوی محیط کشت با غلظت معمولی (Single Strength): هر کدام با ۰.۱ میلیلیتر نمونه آب تلقیح میشوند.
-
-
انکوباسیون: لولهها به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای $35^\circ\text{C} \pm 0.5^\circ\text{C}$ قرار میگیرند.
-
تفسیر: لولههایی که در آنها اسید (تغییر رنگ محیط به زرد) و گاز (ایجاد حباب در لوله دورهام) مشاهده شود، مثبت تلقی میشوند.
۲. مرحله تائیدی (Confirmed Test)
چون ممکن است باکتریهای غیرکلیفورم نیز در مرحله اول گاز تولید کرده باشند، باید آزمایش را تائید کنیم.
-
محیط کشت: از لولههای حاوی محیط کشت بریلیانت گرین بایل برات ۲٪ (BGBB) استفاده میشود که حاوی صفرا (Bile) برای مهار باکتریهای گرم مثبت است.
-
انتقال: با استفاده از آنس (لوپ آزمایشگاهی)، از لولههای مثبت مرحله احتمالی به لولههای BGBB انتقال داده میشود.
-
انکوباسیون: * برای کلیفورمهای تام: ۲۴ تا ۴۸ ساعت در دمای $35^\circ\text{C}$.
-
برای کلیفورمهای فکال (گوارشی): ۲۴ ساعت در حمام آب گرم (بنماری) با دمای دقیق $44.5^\circ\text{C}$.
-
-
تفسیر: تشکیل گاز در لوله دورهام در این مرحله، نشانه قطعی حضور کلیفورمهاست.
۳. مرحله تکمیلی (Completed Test)
این مرحله معمولاً برای کنترل کیفیت نهایی یا در موارد قانونی انجام میشود.
-
کشت خطی: از لولههای مثبت مرحله تائیدی بر روی محیط کشت جامد ائوزین متیلن بلو (EMB) یا اندو آگار (Endo Agar) کشت خطی داده میشود.
-
نشانه مثبت: باکتری ایکولای روی محیط EMB کلونیهایی با جلای سبز فلزی (Metallic Green Sheen) ایجاد میکند.
-
تست نهایی: از این کلونیها مجدداً به لوله لاکتوز برات و لام رنگآمیزی گرم انتقال داده میشود تا تائید شود باکتریها گرم منفی، بدون اسپور و باسيل شکل هستند.
نحوه خواندن و تفسیر جدول MPN
پس از پایان مرحله تائیدی، تعداد لولههای مثبت را در هر سری شمارش میکنیم. به عنوان مثال، اگر در سری اول (۱۰ میلیلیتری) هر ۳ لوله، در سری دوم (۱ میلیلیتری) ۲ لوله و در سری سوم (۰.۱ میلیلیتری) ۱ لوله مثبت شده باشد، کد ما ۳-۲-۱ خواهد بود.
تکنسین آزمایشگاه با مراجعه به جدول آمار MPN (که در مراجع استانداردی مانند Standard Methods وجود دارد)، عدد مربوط به این کد را پیدا میکند. این عدد نشاندهنده شاخص MPN در ۱۰۰ میلیلیتر آب است.
نمونهای از جدول محاسباتی MPN (سیستم ۳ لولهای)
| تعداد لولههای مثبت (۱۰ میلیلیتر) | تعداد لولههای مثبت (۱ میلیلیتر) | تعداد لولههای مثبت (۰.۱ میلیلیتر) | عدد MPN در ۱۰۰ میلیلیتر آب |
| ۰ | ۰ | ۰ | < ۳ (منفی/پاک) |
| ۱ | ۰ | ۰ | ۳ |
| ۳ | ۰ | ۰ | ۲۳ |
| ۳ | ۲ | ۱ | ۱۵۰ |
| ۳ | ۳ | ۳ | > ۲۴۰۰ (آلودگی شدید) |
مزایا و معایب آزمایش میکروبی آب به روش MPN
هر روش آزمایشگاهی نقاط قوت و ضعف خود را دارد. در جدول زیر مزایا و معایب اصلی این روش را بررسی کردهایم:
| مزایای روش MPN | معایب روش MPN |
| مناسب برای نمونههای کدر: برخلاف فیلتراسیون غشایی، ذرات معلق و کدورت آب مانع انجام آزمایش نمیشوند. | زمانبر بودن: برای رسیدن به نتیجه نهایی تائید شده به ۴۸ تا ۷۲ ساعت زمان نیاز است. |
| حساسیت بالا: قادر به شناسایی تعداد بسیار کم باکتری زنده در حجمهای بزرگ است. | دقت آماری و تخمینی: این روش تعداد دقیق را نمیشمارد، بلکه یک تخمین آماری ارائه میدهد. |
| محیطهای احیاکننده: باکتریهای آسیبدیده در محیط مایع شانس بیشتری برای احیا و رشد دارند. | مصرف بالای مواد: به لولهها و محیطهای کشت زیادی نیاز دارد و فضای انکوباتور را پر میکند. |
تجهیزات مورد نیاز برای انجام آزمایش
برای راهاندازی و انجام آزمایش میکروبی آب به روش MPN در یک آزمایشگاه پایش آب، به تجهیزات زیر نیاز است:
-
انکوباتور (شیکردار یا معمولی): با تنظیم دقیق دمای $35^\circ\text{C}$.
-
بنماری (حمام آب گرم) دیجیتال: با دقت بالا برای دمای $44.5^\circ\text{C}$ (مخصوص کلیفورمهای فکال).
-
اتوکلاو: جهت استریل کردن محیطهای کشت و لولههای آزمایش قبل و بعد از کار.
-
لولههای آزمایش و لولههای دورهام: برای مشاهده گاز تولید شده.
-
محیطهای کشت دهيدره: شامل لوریل تریپتوز برات، BGBB و EMB آگار.
-
پیپتهای استریل و هود میکروبیولوژی (کلاس II): برای حفظ ایمنی و جلوگیری از آلودگیهای جانبی.
نکات کلیدی و الزامات استاندارد در نمونهبرداری آب
نتیجه یک آزمایش دقیق میکروبی، به شدت به نحوه نمونهبرداری وابسته است. حتی اگر آزمایش میکروبی آب به روش MPN با بالاترین دقت انجام شود، یک اشتباه در نمونهبرداری میتواند نتیجه را کاملاً بیارزش کند.
-
ظروف استریل: نمونهبرداری باید حتماً در ظروف شیشهای یا پلاستیکی استریل انجام شود.
-
عامل خنثیکننده کلر: اگر آب مورد آزمایش کلر زده شده باشد (مثل آب شهری یا استخر)، باید به ظرف نمونهبرداری پیش از استریل شدن، ماده تیوسولفات سدیم ($Na_2S_2O_3$) اضافه شود تا کلر باقیمانده را خنثی کند و مانع از بین رفتن باکتریها در فاصله انتقال به آزمایشگاه شود.
-
شستشوی شیر: قبل از گرفتن نمونه از شیر آب، باید اجازه داد آب به مدت ۲ الی ۳ دقیقه جریان داشته باشد و دهانه شیر با شعله یا الکل ضدعفونی شود.
-
زنجیره سرد: نمونهها باید در کنار یخ (دمای زیر $10^\circ\text{C}$) نگهداری شده و حداکثر ظرف مدت ۶ تا ۲۴ ساعت به آزمایشگاه منتقل شوند.
جمعبندی و نتیجهگیری
آزمایش میکروبی آب به روش MPN به عنوان یک استاندارد طلایی در صنعت آب و فاضلاب، ابزاری قدرتمند و انعطافپذیر برای سنجش سلامت بهداشتی آب است. اگرچه روشهای سریعتری مانند روشهای ژنتیکی (PCR) یا فیلتراسیون غشایی وجود دارند، اما توانایی روش MPN در آنالیز آبهای کدر، کثیف و با بار آلودگی بالا، جایگاه آن را در مراجع استاندارد بینالمللی مانند WHO و EPA حفظ کرده است. اجرای دقیق مراحل سهگانه (احتمالی، تائیدی و تکمیلی) و رعایت اصول نمونهبرداری، تضمینکننده سلامت جامعه و پیشگیری از شیوع بیماریهای منتقله از آب خواهد بود.